English English Polski Polski
Katedra Biochemii
   
 
Badania


Streszczenia tematów badawczych realizowanych w Katedrze Biochemii w 2017 roku, dofinansowanych przez NCN, z funduszu służącemu rozwojowi młodych naukowców SGGW oraz z działalności statutowej Katedry Biochemii.


Rola dioksygenazy 9-cis-epoksykarotenoidowej oraz 8'-hydroksylazy ABA w regulacji spoczynku nasion pszenżyta. Projekt NCN nr: 2012/07/B/NZ9/01765 Kierownik: dr Edyta Zdunek-Zastocka, wykonawcy: dr Anna Góra-Sochacka, dr inż. Agnieszka Grabowska, dr inż. Beata Prabucka, dr Justyna Fidler, mgr Aneta Więsyk

 

Przeprowadzone w ramach projektu badania wykazały że, zawartość kwasu abscysynowego (ABA), wynikająca ze zróżnicowanej zdolności ziarniaków do jego biosyntezy jak i katabolizmu, jest jednym z czynników determinujących spoczynek oraz podatność ziarniaków pszenżyta na przedżniwne porastanie. Analiza ekspresji genów sugeruje, że w regulacji zawartości ABA w ziarniakach pszenżyta istotną rolę odgrywa gen kodujący dioksygenazę 9-cis-epoksykarotenoidową – TsNCED1, enzym szlaku biosyntezy ABA, oraz dwa geny kodujące 8’-hydroksylazę ABA – TsABA8’OH1 i TsABA8’OH2, enzym szlaku katabolizmu ABA.

Analiza funkcjonalna potwierdziła udział TsNCED1 w biosyntezie ABA w nasionach. Nasiona transgenicznych roślin tytoniu z nadekspresją tego genu charakteryzowały się bowiem wyższą o około 50% zawartością ABA w porównaniu do nasion roślin typu dzikiego. We wszystkich badanych, transgenicznych liniach tytoniu obserwowano ponadto opóźnione kiełkowanie nasion. Po 6 dniach od rozpoczęcia imbibicji zaobserwowano bowiem, że nasiona roślin transgenicznych z nadekspresją TsNCED1 kiełkowały w 20-40%, podczas gdy nasiona roślin typu dzikiego w ponad 80%.

Analiza funkcjonalna potwierdziła również udział TsABA8’OH2 w katabolizmie ABA. Nasiona transgenicznych roślin tytoniu z nadekspresją tego genu charakteryzowały się niższą o około 20% zawartością ABA w porównaniu do nasion roślin typu dzikiego. Ponadto nasiona roślin transgenicznych kiełkowały szybciej niż nasiona roślin dzikich. W 4 dniu po rozpoczęciu imbibicji, nasiona roślin transgenicznych kiełkowały w 25-40% (w zależności od linii),  natomiast nasiona roślin dzikich tylko w około 3%. Nasiona roślin transgenicznych charakteryzowały się również mniejszą wrażliwością na egzogenny ABA. Po 16 dniach od rozpoczęcia imbibicji, nasiona roślin transgenicznych kiełkowały w obecności 10 µM ABA w 35-40%, natomiast roślin dzikich tylko w 13%.

Uzyskane wyniki wskazują nie tylko na udział TsNCED1 oraz TsABA8’OH2 w regulacji zawartości ABA w nasionach, ale również w regulacji spoczynku nasion.

 

Klonowanie i analiza ekspresji UDP-glukozylotransferazy ABA w siewkach pszenżyta poddanych stresowi suszy. Grant SGGW nr: 505-10-011300-P00153-99. Kierownik: dr Justyna Fidler, wykonawca: dr Edyta Zdunek-Zastocka

 

Rośliny w okresie wzrostu i rozwoju są narażone na działanie niekorzystnych warunków środowiskowych. Obecnie jednym z najczęściej występujących stresów środowiskowych jest deficyt wody. Wpływa on ograniczająco na produktywność roślin uprawnych, powodując znaczne straty w rolnictwie. Istotną rolę w odpowiedzi roślin na stres suszy odgrywa kwas abscysynowy (ABA), który reguluje zamykanie aparatów szparkowych oraz indukuje ekspresję genów związanych z odpowiedzią rośliny na suszę. Procesy, w których pośredniczy kwas abscysynowy, są skorelowane ze zmianami zawartości tego fitohormonu w tkankach roślinnych. Stężenie endogennego ABA jest regulowane poprzez utrzymywanie odpowiedniej równowagi pomiędzy dwoma działającymi równolegle procesami, biosyntezą i katabolizmem. ABA może być przekształcany w formę nieaktywną między innymi poprzez hydroksylację lub koniugację z glukozą, w reakcji katalizowanej przez UDP-glukozylotransferazę ABA (ABA UGT). Najnowsze doniesienia wskazują na udział UDP-glukozylotransferazy ABA w regulacji stężenia tego fitohormonu w odpowiedzi na zmieniające się warunki środowiska.

W ramach badań przeprowadzonych w 2017 roku zidentyfikowano pełnej długości sekwencję cDNA UDP-glukozylotransferazy u pszenżyta (Triticosecale UGT1 – TsUGT1). Sekwencja ta składa się z 1736 pz, z czego sekwencję kodującą stanowi 1488 pz. Sekwencja aminokwasowa TsUGT1 wykazuje ponad 40% identyczności względem sekwencji aminokwasowych specyficznych wobec ABA UDP-glukozylotransferaz z rzodkiewnika i fasoli. Wstępne badania wykazały wzrost poziomu transkryptu TsUGT1 w siewkach pszenżyta poddanych 2-dniowemu stresowi suszy. Po ponownym uwodnieniu obserwowano obniżenie poziomu mRNA TsUGT1. Uzyskane wyniki wskazują, że TsUGT1 może odgrywać rolę w regulacji metabolizmu ABA u pszenżyta w odpowiedzi na deficyt wody.

 

Analiza mitochondrialnych białek karbonylowanych w liściach pszenicy jarej w warunkach deficytu wody. Grant SGGW nr 505-10-011300-P00155-99 Kierownik: dr Marta Gietler, wykonawca: dr inż. Małgorzta Nykiel

 

Karbonylacja jest modyfikacją oksydacyjną białek indukowaną przez reaktywne formy tlenu (ROS) i reaktywne formy azotu (RNS) lub produkty uboczne stresu oksydacyjnego. Prowadzi do utraty funkcji biologicznej białka, jednak najnowsze badania wskazują, że może odgrywać znaczącą rolę w kontrolowaniu procesów fizjologicznych. Obecność białek karbonylowanych odkryto, we wszystkich przedziałach komórkowych, jednakże najwyższy ich poziom wykazano w mitochondriach, które są głównym źródłem ROS. Deficyt wody zwiększa zapotrzebowanie roślin na ATP, dlatego zrozumienie wpływu karbonylacji na aktywność białek mitochondrialnych i metabolizm energetyczny komórki roślinnej wydaje się być niezbędny do poznania mechanizmów warunkujących odporność roślin na stres suszy.

Wstępne badania wykazały, że zmiana liczebności białek karbonylowanych w odpowiedzi na stres znacząco różni się w siewkach tolerancyjnych i wrażliwych na odwodnienie. W warunkach kontrolnych w siewkach tolerancyjnych i wrażliwych  zidentyfikowano ok. 23 (±3) białek karbonylowanych natomiast w wyniku dehydratacji ilość białek karbonylowanych zwiększała się prawie dwukrotnie w siewkach tolerancyjnych i wynosiła 41 (±5), podczas gdy w siewkach wrażliwych utrzymywała się na stałym poziomie. W kolejnym etapie badań planuje się identyfikację białek karbonylowanych, która zostanie przeprowadzona Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN.

 

Oksydacyjne modyfikacje RNA w pędach Arabidopsis thaliana porażonych nicieniem cystowym Heterodera schachtii. Grant SGGW nr: 505-10-011300-N00218-99 Kierownik: dr Mateusz Labudda

 

Udział reaktywnych form tlenu (RFT) w odpowiedzi roślin naczyniowych na różnorodne stresy środowiskowe jest dobrze poznany. Wiadomo również, że w wyniku zwiększonej produkcji RFT oraz w warunkach zaburzonej równowagi oksydacyjno-redukcyjnej w tkankach roślinnych może dochodzić do oksydacyjnych modyfikacji cząsteczek występujących w komórkach (peroksydacja lipidów, utlenianie grup SH i karbonylacja białek, oksydacyjne modyfikacje cukrowców i kwasów nukleinowych). Peroksydacja lipidów i karbonylacja białek są najlepiej poznanymi uszkodzeniami składników komórek. Pomimo doniosłej roli, którą pełni RNA w przenoszeniu informacji genetycznej, wiedza na temat jego oksydacyjnych uszkodzeń w komórkach roślin naczyniowych jest znikoma. Dlatego sprawdzenie czy oksydacyjne modyfikacje RNA są indukowane w rzodkiewniku pospolitym w wyniku porażenia mątwikiem burakowym wydaje się istotnym elementem badania skomplikowanych oddziaływań nicienia z rośliną oraz może w znaczący sposób przyczynić się do lepszego zrozumienia pasożytnictwa w świecie roślin. Badania zostały przeprowadzone na roślinach Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotypu Columbia uzyskanych ze sterylnej kultury agarowej. Korzenie dwutygodniowych roślin były inokulowane larwami inwazyjnymi (J2) mątwika burakowego Heterodera schachtii Schmidt. Pędy roślin kontrolnych i porażonych były zbierane w 3, 5, 7 oraz 15 dniu po inokulacji (dpi). Całkowite RNA zostało oczyszczone z pędów z wykorzystaniem metody kolumienkowej oraz potraktowane nukleazą oraz fosfatazą alkaliczną. Stopień oksydacyjnych modyfikacji RNA został oceniony z wykorzystaniem metod immunoenzymatycznych ELISA. Zawartość 8-hydroksyguanozyny (marker utlenionego RNA) oceniono ilościowo w próbach całkowitego RNA. Wyniki pokazują, że zawartość 8-hydroksyguanozyny nie różniła się w poszczególnych próbach kontrolnych podczas całego okresu prowadzenia obserwacji. Zauważono jednak, że rośliny porażone charakteryzowały się podwyższoną zawartością 8-hydroksyguanozyny w próbach RNA z pędów roślin zebranych trzeciego oraz piątego dnia po inokulacji. Co ciekawe, w 7 dpi i 15 dpi nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy roślinami kontrolnymi a porażonymi. Siódmego i piętnastego dnia po inokulacji, w roślinach porażonych poziom utlenionego RNA został przywrócony do niemal takiego samego poziomu jak w roślinach kontrolnych, co może wskazywać na to, że rośliny porażone były zdolne do uruchomienia mechanizmów obronnych i/bądź naprawczych.

 

Badania finansowane z działalności statutowej Katedry Biochemii.

 

 

Metabolizm kwasu abscysynowego w roślinach grochu w warunkach stresu wywołanego jonami kadmu Wykonawcy dr Edyta Zdunek-Zastocka, dr inż. Agnieszka Grabowska, mgr Beata Michniewska

 

Kwas abscysynowy (ABA) to hormon roślinny regulujący wiele procesów związanych z wzrostem i rozwojem roślin oraz ich adaptacją do niekorzystnych warunków środowiska. W odpowiedzi na stres wywołany jonami kadmu, przyczynia się on do ograniczenia  pobierania Cd przez korzenie, zahamowania translokacji Cd do liści oraz bierze udział w szlakach transdukcji sygnału i indukcji syntezy fitochelatyn. Pomimo, że wzrost zawartości ABA w odpowiedzi na Cd obserwowano w tkankach kilku gatunków roślin, miejsca biosyntezy ABA jak i jego katabolizmu w warunkach stresu wywołanego metalami ciężkimi pozostają w dużej mierze niewyjaśnione.

W niniejszym doświadczeniu zbadano ekspresję genów kodujących enzymy zaangażowane w biosyntezę ABA (Pisum sativum dioksygenazę 9-cis-epoksykarotenoidową - PsNCED; Pisum sativum oksydazę aldehydową - PsAO) oraz jego katabolizm (Pisum sativum 8'-hydroksylazę ABA - PsABA8'OH; Pisum sativum UDP-glukozylotransferazę ABA – PsUGT-ABA) w roślinach grochu uprawianych na pożywkach zawierających 50 μM CdCl2. Wzrost zawartości ABA obserwowany był tylko w liściach, już po 5 godzinach po wprowadzeniu jonów Cd do pożywki. Spośród liści grochu różnych wiekiem (A- najmłodsze, nie w pełni rozwinięte liście; B- pełni rozwinięte liście; C- stare liście), najwyższą zawartość ABA zaobserwowano w najmłodszych liściach (A), zarówno w warunkach kontrolnych jak i w warunkach stresu. Jednak analiza profili ekspresji genów PsNCED2, PsNCED3 i PsAO3 wskazuje, że to w pełni rozwinięte (B) i najstarsze liście (C) są głównymi miejscami syntezy ABA w odpowiedzi na stres wywołany kadmem. Wzrost ekspresji genów kodujących enzymy biosyntezy ABA zaobserwowano również w korzeniach grochu, czemu towarzyszył wzrost ekspresji genu PsUGT1-ABA. Może to sugerować, że w pierwszych godzinach po wprowadzeniu jonów Cd do pożywki, synteza ABA zachodzi także w korzeniach, gdzie ABA jest następnie przekształcany w formę transportową - ester glukozowy ABA, w postaci której jest on transportowany do liści. Wprowadzenie jonów Cd do pożywki nie wpływało znacząco na ekspresję PsABA8'OH1 i PsABA8'OH2, zarówno w korzeniach jak i liściach. Uzyskane wyniki wykazały, że jony Cd indukują ekspresję genów zaangażowanych w biosyntezę ABA, zarówno w korzeniach jak i liściach grochu, jednak akumulacja ABA ma miejsce tylko w liściach prawdopodobnie w celu ograniczenia szybkości transpiracji, a co za tym idzie pobierania Cd przez korzenie i jego transportu do liści.

 

Rola dehydrogenazy glutaminianowej pszenżyta podczas stresu solnego. Wykonawcy: dr inż. Agnieszka Grabowska, dr Edyta Zdunek-Zastocka

 

Dehydrogenaza glutaminianowa (GDH, EC 1.4.1.2-3) jest enzymem katalizującym redukcyjną aminację 2 -oksoglutaranu prowadzącą do powstania kwasu glutaminowego. U wielu gatunków roślin GDH jest heksametrem, który zbudowany jest z dwóch typów podjednostek: α i β, które kodowane są przez oddzielne geny. U pszenżyta zostały sklonowane dwa geny kodujące GDH: TsGDH1 (podjednostka β) oraz TsGDH2 (podjednostka α). Aby sprawdzić jakie funkcje pełnią sklonowane geny roślina modelowa – rzodkiewnik został stransformowany konstruktami genetycznymi do nadekspresji: 35S::TsGDH1s oraz 35S::TsGDH2s. Otrzymane linie transgeniczne fenotypowo nie różniły się od roślin typu dzikiego, kiedy uprawiane były w standardowych warunkach, jednak charakteryzowały się zwiększoną aktywnością aminacyjną i deaminacyjną dehydrogenazy glutaminianowej w porównaniu z roślinami kontrolnymi. Natomiast kiedy rośliny uprawiane były w warunkach umiarkowanego zasolenia: 50 mM NaCl, w roślinach transgenicznych obserwowano większą biomasę, wyższą zawartość chlorofilu oraz aktywność GDH w porównaniu z roślinami dzikimi. Uzyskane wyniki wskazują na udział dehydrogenazy glutaminianowej pszenżyta w odpowiedzi na stres solny.

 

Charakterystyka biochemiczna lakazy syntetyzowanej przez Chaetomium globosum. Wykonawcy: dr hab. Urszula Jankiewicz, mgr Agnieszka Gałazka

 

Grzyby Chaetomium globosum wydzielają enzymy ligninolityczne i z tego względu są zaliczone do grzybów tzw. rozkładu szarego, czyli względnie niskiej aktywności destrukcyjnej w rozkładzie drewna. Wśród enzymów ligninolitycznych wyróżniamy lakazy [EC 1.10.3.2], enzymy należące do klasy oksydoreduktaz. Są to enzymy o niskiej specyficzności substratowej, przeprowadzające reakcje utleniania związków organicznych i nieorganicznych. Ponadto są to enzymy o wysokim potencjale aplikacyjnym w ochronie środowiska naturalnego. Celem przeprowadzonych badań było ustalenie, czy lakaza syntetyzowana przez grzyb Chaetomium globosum ma zdolność do degradacji wybranych związków chemicznych, które występują w środowisku, jako zanieczyszczenie. Ponadto scharakteryzowano badany enzym pod względem biochemicznym. Jak wykazała analiza zymogramu, Chaetomium globosum wydziela do środowiska jedno białko enzymatyczne o aktywności lakazy. Badana lakaza charakteryzuje się wysokim optimum temperaturowym – 55°C oraz stabilnością termiczną, jest aktywna w środowisku kwaśnym, pH 3-6. Oczyszczony enzym wykazywał dużą zdolność do rozkładu barwników, pochodnych amin aromatycznych. Aktywność lakazy była wzmacniana w obecności hydroksybenzotriazolu (HBT), mediatora reakcji redox.

 

Regulacja aktywności endopeptydaz kiełkujących ziarniaków pszenżyta. Wykonawcy: dr inż. Beata Prabucka, dr inż. Agnieszka Grabowska

 

Hydroliza białek zapasowych jest jednym z kluczowych procesów towarzyszących kiełkowaniu ziarniaków zbóż. Za przebieg tego procesu odpowiedzialne są endopeptydazy cysteinowe. Za masową hydrolizę prolamin bielma skrobiowego ziarniaków pszenżyta odpowiedzialne są endopeptydazy cysteinowe z rodziny papainy (C1). Regulacja aktywności endopeptydaz cysteinowych biorących udział w kiełkowaniu ziarniaków odbywa się generalnie na dwóch poziomach: hormonalnej indukcji syntezy pod wpływem giberelin oraz postulowanej, jakkolwiek dotąd niepotwierdzonej, regulacji aktywności pod wpływem fitocystatyn. Natomiast endopeptydazom cysteinowym z rodziny legumainy (C13) przypisuje się rolę regulacyjną w licznych procesach metabolicznych. Jak dotąd ustalono pełną sekwencję pszenżytniej formy beta legumainy, której homolog jęczmienny opisywany jest w literaturze jako ulegający ekspresji we wczesnej fazie wykształcania się ziarniaków oraz podczas ich kiełkowania, co potwierdzają nasze badania, a także wyizolowano gen ludzkiego homologa (forma alfa) legumainy, eksprymowanego podczas rozwoju ziarniaków oraz w organach wegetatywnych. Wyizolowane sekwencje posłużą do uzyskania białek rekombinowanych obydwu form enzymu co pozwoli na zbadanie ich właściwości i umożliwi pełniejsze poznanie funkcji tych enzymów, w tym zbadanie interakcji z uzyskanym białkiem rekombinowanym pszenzytniej dwudomenowej fitocystatyny TrcC-8 z rozszerzeniem na C-końcu, której homologi hamują aktywność endopeptydaz cysteinowych z rodziny legumainy.

 

Wpływ suszy na zawartość cukrów rozpuszczalnych i skrobi w liściach Solanum tuberosum L. Wykonawcy: Ilona Cisowska, mgr inż. Dorota Marecka, dr inż. Sławomir Orzechowski

 

Niedobór wody jest zjawiskiem niekorzystnie oddziaływującym na plonowanie roślin. W najbliższych latach prognozowane jest ocieplenie klimatu, które w połączeniu z brakiem zmian w ilości opadów, może przyczynić się do coraz częściej występujących zjawisk suszy. W doświadczeniu wazonowym, wykonanym w szklarni, materiałem były liście ziemniaka odmiany Desiree. Wskaźnikiem suszy był współczynnik względnej zawartości wody (RWC). Oznaczenia wykonano w liściach pobranych z roślin poddanych działaniu stresu suszy i kontrolnych. Próby pobierano w tygodniowych odstępach, począwszy od dnia rozpoczęcia doświadczenia. W liściach po izolacji oznaczono zawartość skrobi, glukozy, fruktozy i sacharozy. Uzyskane wstępne wyniki pozwalają wskazać suszę jako przyczynę obniżenia RWC oraz znacznego spadku zawartości skrobi, glukozy, fruktozy i sacharozy w liściach Solanum tuberosum L.

 



 
Top! Top!
cookies