English English Polski Polski
Katedra Biochemii
   
 
Badania

 

Streszczenia tematów badawczych realizowanych w Katedrze Biochemii w 2018 roku, dofinansowanych przez NCN, z funduszu służącemu rozwojowi młodych naukowców SGGW oraz z działalności statutowej Katedry Biochemii.

 

Aktywność wakuolarnych enzymów przetwarzających w odpowiedzi jęczmienia jarego na infekcję mątwikiem zbożowym. Projekt NCN nr: 2017/01/X/NZ9/01183 Kierownik: dr Mateusz Labudda, wykonawcy: dr inż. Beata Prabucka, dr Elżbieta Różańska, dr inż. Mirosław Sobczak

Nicienie pasożytujące na korzeniach roślin są istotnym problemem polskiego i światowego rolnictwa. Porażają one tak istotne dla produkcji żywności i biopaliw rośliny uprawne jak burak cukrowy, ziemniak, kukurydza, pomidor, soja, czy rzepak. Ich żerowanie na korzeniach rośliny żywicielskiej, powoduje zarówno głębokie metaboliczne zmiany w porażonych korzeniach, jak też ogólnoustrojową odpowiedź całej porażonej rośliny. Należy zauważyć, że większość międzynarodowych zespołów badawczych skupia się jedynie na pogłębianiu wiedzy na temat lokalnej odpowiedzi rośliny w miejscu infekcji (korzeniu), natomiast niewiele badań dotyczy reakcji systemicznej w innych organach rośliny (np. w liściach), dlatego w zrealizowanych badaniach główny nacisk został położony na zagadnienie związane z holistyczną odpowiedzią systemiczną porażonych roślin. Wykonane analizy umożliwiły poznanie zmian ekspresji genów oraz zmian aktywności enzymatycznej wakuolarnych enzymów przetwarzających (VPEs) w organach jęczmienia jarego porażonego zbożowym nicieniem cystowym Heterodera filipjevi. VPEs to enzymy proteolityczne należące do rodziny C13 peptydaz cysteinowych. U roślin naczyniowych VPEs produkowane są w cytozolu w formie nieaktywnych katalitycznie zymogenów. Zymogeny te, po dotarciu do wakuoli, uzyskują zdolność katalizowania reakcji hydrolizy wiązań peptydowych utworzonych z udziałem grupy karbonylowej kwasu asparaginowego lub asparaginy. W ostatnich latach szczególną uwagę poświęcano udziałowi VPEs w procesach rozwoju nasion, ale istnieją doniesienia wskazujące na udział tych enzymów w odpowiedzi roślin na infekcję patogenów. Fizjologiczna rola tych enzymów w procesach odpowiedzi zbóż na infekcję nicieniami cystowymi nie jest w ogóle poznana. Dlatego wymierną wartością zrealizowanego zadania badawczego jest dostarczenie danych doświadczalnych wskazujących na udział tych enzymów w procesach pasożytowania nicieni. Ważny jest również, wybór modelu doświadczalnego jęczmień jary/mątwik zbożowy. Mątwik zbożowy to trudny do zwalczenia szkodnik w uprawach zbóż. Natomiast jęczmień jary jest ważną rośliną uprawną i modelem wykorzystywanym w biologii eksperymentalnej zbóż. Tak, więc, niniejsze zadanie badawcze nie tylko podejmuje ważny problem rolniczy, ale stwarza także realne podstawy dla lepszego rozumienia mechanizmów systemu odpornościowego roślin uprawnych. Podsumowując, zrealizowane zadanie badawcze wpisuje się w nurt biologicznych badań podstawowych, jednak z realną szansą na ich praktyczne wykorzystanie w hodowli odpornościowej roślin.

 

Udział receptorów PYR/PYL w regulacji wrażliwości zarodków ziarniaków pszenżyta na ABA. Projekt NCN nr: 2018/02/X/NZ9/00786. Kierownik: dr Justyna Fidler

Kwas abscysynowy (ABA) jest zaangażowany w wiele procesów związanych z wykształcaniem i dojrzewaniem nasion, m.in. rozwój zarodka, nabywanie tolerancji na odwodnienie oraz indukcję i podtrzymanie spoczynku. Przyjmuje się, że wysokie stężenie tego fitohormonu w rozwijających się nasionach uniemożliwia ich kiełkowanie. Dopiero podczas postępującego odwodnienia nasion, któremu towarzyszy stopniowe obniżanie zawartości ABA, nasiona niektórych gatunków mogą wykazywać zdolność kiełkowania. W przypadku zbóż głębokość spoczynku bezpośrednio wpływa na jakość plonu. Płytki spoczynek jakim charakteryzują się niektóre odmiany ważnych gatunków zbóż, w tym pszenżyto, może prowadzić do przedżniwnego porastania, czyli kiełkowania ziarniaków znajdujących się w kłosie. Nie zawsze jednak obserwuje się ścisłą zależność pomiędzy zawartością ABA w nasionach a spoczynkiem, dlatego też postuluje się, że nie tylko zawartość ABA, ale również wrażliwość na ten fitohormon odgrywa istotną rolę w regulacji spoczynku nasion i wpływa na ich zdolność kiełkowania.

Percepcja ABA odbywa się poprzez wiązanie tego fitohormonu do białkowych receptorów typu PYR/PYL (ang. pyrabactin resistance/pyrabactin resistance-like). Po związaniu ABA receptory PYR/PYL blokują aktywność fosfataz białkowych 2C (ang. protein phosphatase type 2C), co z kolei aktywuje kinazy białkowe typu SnRK2 (ang. SNF1-related protein kinase 2), które fosforylując odpowiednie substraty (czynniki transkrypcyjne i białka) prowadzą do wywołania odpowiedzi fizjologicznych związanych z ABA. Przeprowadzone dotychczas badania wskazują, że głównym komponentem ścieżki sygnałowej, od którego zależy wrażliwość tkanek roślinnych na ABA są receptory PYR/PYL. Białka te są kodowane przez rodzinę genów, które mogą ulegać ekspresji w różnych tkankach i pod wpływem różnych czynników. Dane literaturowe dotyczące poszczególnych elementów kaskady sygnałowej ABA u roślin jednoliściennych, w tym ważnych z gospodarczego punktu widzenia zbóż, są bardzo ograniczone, stąd też celem niniejszego projektu jest identyfikacja i analiza ekspresji genów kodujących białka receptorowe PYR/PYL w zarodkach dojrzewających ziarniaków pszenżyta dwóch odmian znacznie różniących się podatnością na przedżniwne porastanie. Na podstawie uzyskanych wyników będzie można wytypować geny z rodziny kodującej białka PYR/PYL, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w tych ziarniakach i potencjalnie mogą odgrywać rolę w regulacji spoczynku, a tym samym wpływać na podatność odmian pszenżyta na przedżniwne porastanie.

 

Analiza mitochondrialnych białek karbonylowanych w liściach pszenicy jarej w warunkach deficytu wody. Grant SGGW Nr 505-10-011300-POO155-99 Kierownik: dr Marta Gietler, Wykonawca: dr inż. Małgorzata Nykiel

Pierwotny stres suszy generuje wtórny stres oksydacyjny, w wyniku którego dochodzi do nadmiernej produkcji reaktywnych form tlenu (RFT) i zaburzenia homeostazy oksydacyjno-redukcyjnej komórki. Wysoka zawartość RFT prowadzi m. in do oksydacyjnych modyfikacji potranslacyjnych białek. Za najpowszechniejszą modyfikację wywoływaną przez RFT, będącą jednocześnie wskaźnikiem stresu oksydacyjnego, uważa się karbonylację. Obecność białek karbonylowanych wykazano we wszystkich kompartmentach komórki roślinnej, jednakże liczne badania sugerują, że ze względu na szczególnie wysoką zawartością RFT w mitochondriach, koncentracja białek modyfikowanych w tym organellum jest największa.

Celem pracy była analiza mitochondrialnego proteomu w warunkach suszy oraz wskazanie kluczowych białek których stopień karbonylacji uległ zmianie w odpowiedzi na stres deficytu wody w siewkach pszenicy jarej charakteryzujących się różną tolerancyjnością na odwodnienie.

Badania wykazały, że zmiana liczebności białek karbonylowanych w odpowiedzi na stres znacząco różni się w siewkach tolerancyjnych i wrażliwych na odwodnienie. Zawartość karbonylowanych białek mitochondrialnych zwiększała się prawie dwukrotnie w siewkach tolerancyjnych podczas gdy w siewkach wrażliwych utrzymywała się na stałym poziomie.

Zmiany karbonylacji dotyczyły białek związanych z utrzymaniem homeostazy redoks (m. in peroksyredoksyna), białek opiekuńczych (białka szoku cieplnego Hsp70), enzymów cyklu kwasu cytrynowego (dehydrogenaza bursztynianowi; ligaza bursztynylo-CoA) oraz oddychania komórkowego i metabolizmu podstawowego.

 

Wpływ wywaru z liści orzecha włoskiego (Juglans regia L.) na wzrost bakterii fitopatogennych. Grant SGGW nr: 505-10-011300-Q00209-99 Kierownik: dr Zbigniew Wyżewski

Choroby bakteryjne i grzybicze roślin mogą być przyczyną straty plonu i/lub obniżenia jego jakości, co pociąga za sobą praktyczne i ekonomiczne problemy w obszarze produkcji żywności. Różne części orzecha włoskiego (Juglans regia L.) – mogą być wykorzystane jako surowiec zielarski. Liście tej rośliny są źródłem związków chemicznych wykorzystywanych w profilaktce zakażeń drobnoustrojami. Badania wykazały, że ekstrakt z liści orzecha włoskiego hamuje wzrost bakterii Streptococcus mutans, S. salivarius, S. sanguinis Actinomyces viscosus. Zainteresowanie przeciwbakteryjnymi właściwościami orzecha włoskiego było – jak dotąd – przejawiane przede wszystkim w kontekście medycyny ludzkiej. Badania pozwalające ustalić, czy preparaty z liści orzecha włoskiego mogą wpływać na wzrost bakteryjnych fitopatogenów, przenosi poruszaną problematykę w sferę zagadnień biologicznych i rolniczych. Celem podjętych badań jest wstępna ocena efektywności wywaru z liści orzecha włoskiego, naturalnego środka przeciwdrobnoustrojowego, w walce z bakteriami, które jako patogeny roślin stanowią zagrożenie dla upraw rolnych i narażają właścicieli gospodarstw na poważne straty. Aby ocenić bakteriobójczy potencjał wywaru z liści orzecha włoskiego, zastosowano metodę dyfuzyjno-krążkową (Kirby-Bauera): zmierzono strefę zahamowania wzrostu bakterii na szalce z zestalonym agarem odżywczym, wokół krążków nasączonych wywarem o różnych stężeniach, pozyskanym zgodnie z procedurą opisaną przez Tyszyńską-Kownacką i Starek. Wstępne badania wykazały, że spośród czterech przebadanych szczepów bakterii fitopatogennych, dwa izolaty Serratia marcescens są niewrażliwe na działanie wywaru. Natomiast na szalkach z Pectobacterium carotovorum oraz Pseudomonas syringae zaobserwowano strefę zahamowania wzrostu. Zagadnienie wymaga dalszych badań i prób udoskonalenia procedury pozyskiwania wywaru lub ekstraktu z liści orzecha włoskiego.


 

Wpływ suszy na rozkład węglowodanów w liściach Solanum tuberosum L. Kierownik: dr inż. Sławomir Orzechowski, Wykonawcy Joanna Cania, Magdalena Chądzyńska, mgr inż. Dorota Marecka

Niedobór wody jest zjawiskiem niekorzystnie oddziaływującym na plonowanie roślin. W najbliższych latach prognozowane jest ocieplenie klimatu, które w połączeniu z brakiem zmian w ilości opadów, może przyczynić się do coraz częściej występujących zjawisk suszy. W doświadczeniu wazonowym, wykonanym w szklarni, materiałem doświadczalnym były liście ziemniaka odmiany Desire. Próby pobierano w tygodniowych odstępach, począwszy od dnia rozpoczęcia doświadczenia. Wskaźnik suszy, którym był współczynnik względnej zawartości wody (RWC) osiągnął w 3 tygodniu trwania eksperymentu 50%. Susza powodowała zwiększoną aktywność enzymów degradujących skrobię zarówno hydrolaz: alfa-amylazy (EC 3.2.1.1) i beta-amylazy (EC 3.2.1.2), jak i fosforylazy glukanów (EC 2.4.1.1). Aktywności inwertaz: kwaśnej i cytozolowej (EC 3.2.1.26) hydrolizujących sacharozę w liściach ziemniaka w porównaniu do roślin odpowiednio nawadnianych rosły pod wpływem suszy. Niedobór wody w liściach spowodował ograniczenie fotosyntezy czyli brak możliwości asymilacji CO2 i syntezy skrobi tranzytorycznej. Węglowodany rozpuszczalne i skrobia w liściach poddanych stresowi w porównaniu do roślin kontrolnych są intensywniej rozkładane, istotnie spada ich zawartość w przeliczeniu na suchą masę.

 

Synteza deaminazy kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego (acc) przez endofityczne bakterie jęczmienia. Kierownik: dr hab. Urszula Jankiewicz, wykonawca: mgr Agnieszka Gałązka

U roślin narażonych na stres biotyczny lub abiotyczny obserwuje się podwyższony poziom etylenu o negatywnym wpływie na ich wzrost wegetatywny. Syntetyzowany przez niektóre bakterie i grzyby enzym deaminaza acc [EC 3.5.99.7] obniża u roślin stężenie prekursora etylenu - kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego, co skutkuje obniżeniem w tkankach roślinnych poziomu  samego etylenu. Jest to enzym odgrywający istotną rolę w interakcji mikroorganizm – roślina, a zdolność do jego syntezy uważa się za bezpośredni mechanizm promowania wzrostu roślin.

Aktywność deaminazy acc jest powiązana z syntezą kwasu indolilo – 3 –octowego (IAA). Ten bakteryjny fitohormon wpływa na namnażanie oraz elongację komórek roślinnych, pośrednio przez m.in rozluźnienie ściany komórkowej. IAA indukuje odpowiedź stresową wywołaną etylenem i wpływa na transkrypcję genów związanych z syntazą ACC. Przeprowadzone badania miały na celu detekcję aktywności deaminazy acc u endofitycznych bakterii pochodzących z jęczmienia jarego. W badaniach uzyskano 25 izolatów bakteryjnych, z czego jedynie 3 wykazywały aktywność deaminazy w testach biochemicznych. Natomiast zdolność do syntezy kwasu indolilo – 3 – octowego wykryto u większości badanych szczepów. Po dokonaniu identyfikacji gatunkowej stwierdzono, że są to bakterie z rodzaju Pseudomonas - Pseudomonas putida, P. fluorescens oraz P. migulae. W celu oceny przydatności tych bakterii do doświadczeń z roślinami prowadzonych warunkach stresu solnego i odwodnienia, poddano je także czynnikom stresowym (4% NaCl oraz 15% PEG oraz jony metali ciężkich). Najmniejszą podatność na stres wykazywał Pseudomonas migulae, dlatego dalsze badania będą prowadzone na tym szczepie bakterii.

Genomika funkcjonalna dehydrogenazy glutaminianowej u pszenżyta. Wykonawcy: dr inż. A. Grabowska, dr E. Zdunek-Zastocka

Wykorzystując analizę RT-PCR uzyskano pełnej długości gen kodujący dehydrogenazę glutaminianową (GDH, EC 1.4.1.4) u pszenżyta (TsGDH-NADP, GenBank KU311057). W sklonowanym genie otwarta ramka odczytu obejmuje 1953 pz, co odpowiada 650 aminokwasom. Zdecydowana większość roślinnych GDH współdziała z NAD(H) jako koenzymem i katalizuje odwracalną reakcję redukcyjnej aminacji 2 –oksoglutaranu prowadzącą do powstania kwasu glutaminowego. W przeciwieństwie do GDH-NAD(H) niewiele jest wiadomo na temat roli GDH-NADP(H) u roślin. W celu zbadania funkcji TsGDH-NADP przeprowadzono transformację modelowych rośliny – rzodkiewnika, do których wprowadzono konstrukt genetyczny do nadekspresji pod promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora (35S::TsGDH2s). Transformację wykonano metodę wektorową z użyciem Agrobacterium tumefaciens. Otrzymane transformanty zostały przeanalizowane za pomocą standardowych technik laboratoryjnych takich jak: PCR, RT-PCR, analiza Southern blot w celu potwierdzenia obecności transgenu. Z wybranych roślin transgenicznych otrzymano dwie linie homozygotyczne (T4), które fenotypowo nie różniły się od roślin typu dzikiego, kiedy uprawiane były w standardowych warunkach. Natomiast kiedy rośliny rosły w warunkach niedoboru lub nadmiaru azotu w pożywce obserwowano wyraźnie zwiększoną biomasę, zawartość chlorofilu oraz aktywność GDH-NADP(H) w liniach transgenicznych w porównaniu z roślinami dzikimi. W celu wyjaśnienia funkcji TsGDH-NADP konieczne są dalsze analizy molekularne oraz biochemiczne.

Udział UDP-glukozylotransferazy ABA w regulacji zawartości ABA podczas dojrzewania i kiełkowania nasion grochu. Kierownik: dr Edyta Zdunek-Zastocka, wykonawcy: dr inż. Agnieszka Grabowska, mgr Beata Michniewska.

Stężenie kwasu abscysynowego (ABA), roślinnego hormonu, jest regulowane poprzez utrzymywanie odpowiedniej równowagi pomiędzy dwoma działającymi równolegle procesami, biosyntezą i katabolizmem. Synteza ABA de novo odbywa w drodze rozpadu 40-węglowych karotenoidów, a reakcję decydującą o tempie przemian tego szlaku katalizuje dioksygenza 9-cis-epoksykarotenoidowa (NCED). Przekształcenie ABA w formę nieaktywną może natomiast zachodzić poprzez hydroksylację grupy metylowej w pozycji C-8’, w reakcji katalizowanej przez 8’-hydroksylazę ABA (ABA8’OH), lub koniugację z glukozą, w reakcji katalizowanej przez UDP-glukozylotransferazę ABA (ABAUGT). Analizy roślin transgenicznych wraz z charakterystyką biochemiczną potwierdziły udział NCED oraz ABA8’OH w regulacji stężenia ABA w dojrzewających i kiełkujących nasionach, jednak rola ABAUGT w tym procesie nie jest do końca wyjaśniona, a wiedza na ten temat bardzo ograniczona.

W ramach badań poznano dwie pełnej długości sekwencje cDNA ABAUGT u Pisum sativum, PsABAUGT1 oraz PsABAUGT2, o długości odpowiednio 1611 pz oraz 1684 pz. Wzrost poziom transkryptu PsABAUGT1 korelował ze spadkiem zawartości ABA obserwowanym zarówno w dojrzewających nasionach grochu, w fazie intensywnego odwodnienia nasion pomiędzy 30 a 43 dniem po zapyleniu, oraz w nasionach poddanych imbibicji, w pierwszych 12-tu godzinach od rozpoczęcia imibibicji w wodzie. Obniżeniu ekspresji PsABAUGT1, które miało natomiast miejsce podczas imbibicji nasion w 10-40 mM roztworach H2O2, towarzyszył wzrost zawartości ABA. W wyniku transformacji roślin Arabidopsis thaliana konstruktem genetycznym umożliwiającym nadekspresję PsABAUGT1 (sekwencję PsABAUGT1 wprowadzono do wektora pCAMBIA pod promotorem CaMV35S) otrzymano kilkanaście linii homozygotycznych. Nasiona transgenicznych roślin (pokolenie T4) kiełkowały szybciej niż nasiona roślin dzikich oraz charakteryzowały się obniżoną wrażliwością na egzogenny ABA, co wiązało się z obniżeniem zawartości ABA w wyniku aktywności PsABAUGT1. Otrzymane wyniki dowodzą, że PsABAUGT1 bierze udział w katabolizmie ABA, a tym samym w regulacji jego zawartości, w dojrzewających i kiełkujących nasionach grochu.

 

 



 
Top! Top!
cookies