English English Polski Polski
Katedra Biochemii
   
 
Badania

Streszczenia tematów badawczych realizowanych w Katedrze Biochemii w 2016 roku, dofinansowanych przez NCN, z funduszu służących rozwojowi młodych naukowców SGGW oraz w ramach badań statutowych Katedry Biochemii.

 

Rola dioksygenazy 9-cis-epoksykarotenoidowej oraz 8'-hydroksylazy ABA w regulacji spoczynku nasion pszenżyta. Projekt NCN, numer: 2012/07/B/NZ9/01765 Kierownik projektu: dr Edyta Zdunek-Zastocka, wykonawcy: dr Anna Góra-Sochacka, dr inż. Agnieszka Grabowska, dr inż. Beata Prabucka, mgr Justyna Fidler, mgr Aneta Więsyk

Jednym z czynników ograniczających produkcję zbóż jest proces przedżniwnego porastania (PHS), w którym dochodzi do kiełkowania ziarniaków znajdujących się w kłosie, w wyniku przedwczesnego przełamania spoczynku. Kwas abscysynowy (ABA) jest jednym z hormonów, odgrywających kluczową rolę w regulacji spoczynku i kiełkowaniu nasion. W ramach projektu badano wpływ indukowanego porastania na kiełkowanie, zawartość ABA i ekspresję genów zaangażowanych w jego metabolizm w ziarniakach dwóch odmian pszenżyta różniących się podatnością na PHS. Indukowanemu porastaniu poddano ziarniaki znajdujące się na roślinie matecznej w okresie ich dojrzewania, czyli od 38 do 50 dnia po zapyleniu. Ziarniaki w kłosach pochodzących z roślin z doświadczenia kontrolnego nie kiełkowały, natomiast w warunkach indukowanego porastania obserwowano kiełkowanie ziarniaków obu odmian, przy czym ziarniaki odmiany Leontino, charakteryzującej się większą podatnością na przedżniwne porastanie, kiełkowały w niemal 40 % w 12 dniu od indukcji porastania, podczas gdy ziarniaki odmiany Fredro, o mniejszej podatności na to niekorzystne zjawisko, kiełkowały w około 10 %. Różnice w kiełkowaniu ziarniaków obu odmian, poddanych indukowanemu porastaniu, mogą być wynikiem różnic w zawartości ABA, gdyż niemal dwukrotnie wyższe stężenie tego fitohormonu obserwowano w ziarniakach odmiany Fredro. Wyższa zawartość ABA w ziarniakach odmiany Fredro była skorelowana z wyższą ekspresją genu TsNCED1 kodującego jeden z enzymów ze szlaku biosyntezy ABA – dioksygenazy 9-cis-epoksykarotenoidowej. Ponadto zaobserwowano, że ekspresja genów TsABA8’OH1 oraz TsABA8’OH2, kodujących 8’-hydroksyklazę ABA, zaangażowaną w katabolizm tego fitohormonu, w ziarniakach odmiany Fredro była niższa niż w ziarniakach odmiany Leontino. Zawartość ABA jak i ekspresja genów zaangażowanych w jego metabolizm podczas dojrzewania i kiełkowania ziarniaków może być jednym z czynników decydujących o podatności ziarniaków pszenżyta na PHS.

 

Analiza zmian profili proteomicznych białek ulegających wybranym modyfikacjom oksydoredukcyjnym na skutek dehydratacji. Grant wewnętrzny nr: 505-10-011300-M00228-99 Kierownik: mgr Marta Gietler, Wykonawcy: dr inż. Małgorzata Nykiel (promotor pomocniczy), prof. dr hab. Barbara Zagdańska (promotor)

Siewki pszenicy wykazują utratę tolerancji odwodnienia piątego dnia po imbibicji, która jest związana z zaburzeniami komórkowego stanu redoks. Zostało to potwierdzone przez zmianę stosunku zredukowanego do utlenionego glutationu w kierunku bardziej utlenionego stanu oraz przez znaczący wzrost stosunku białkowych tioli do całkowitej zawartości tioli. Identyfikacja i charakterystyka białek wrażliwych na zmiany potencjału redoks jest ważnym zagadnieniem pozwalającym zrozumieć molekularne mechanizmy utraty tolerancji odwodnienia. Porównano profile białkowe z siewek w pełnym turgorze (kontrola) i siewek poddanych dehydratacji. Białka istotne statystycznie (p<0.05), których ilość zmieniła się przynajmniej dwukrotnie, zostały wyselekcjonowane przez program Delta2D jako różnicujące i poddane identyfikacji przez MALDI-TOF i LC-MS/MS. Klasyfikacji białek  dokonano na podstawie pełnionych funkcji. Wykazano, że tolerancja na odwodnienie jest głównie związana z metabolizmem energetycznym oraz metabolizmem białek i kwasów nukleinowych. Zarówno S-nitrozylacji jak i S-glutationylacji w warunkach niedoboru wody ulegały białka: tioniny BTH6 i DB4, chloroplastowe białko L16 podjednostka 50S rybosomu, fosfolipaza A1-II delta i chloroplastowa tioredoksyna M2. Wykazaliśmy, że S-nitrozylacja i S-glutationylacja, które są regulowane przez stan redoks, mogą wzmacniać mechanizmy obronne roślin i/lub brać udział w aklimatyzacji roślin do niekorzystnych czynników środowiska.

 

Aktywność proteaz oraz ekspresja fitocystatyn Arabidopsis thaliana po infekcji Heterodera schachtii. Projekt SGGW, numer: 505-10-011300-L00376-99 Kierownik projektu: mgr Mateusz Labudda, wykonawca: dr hab. Jolanta Maria Dzik (promotor)

Enzymy proteolityczne roślin wyższych uczestniczą w wielu procesach komórkowych. Biorą udział w metabolizmie aminokwasów, usuwaniu uszkodzonych białek, jak również w reakcjach obronnych przeciw patogenom. Dlatego sprawdzenie czy proteazy oraz ich endogenne inhibitory – fitocystatyny  są zaangażowane w odpowiedź obronną rzodkiewnika pospolitego na porażenie mątwikiem burakowym wydaje się ważne dla badania skomplikowanych oddziaływań nicienia z rośliną. Przeprowadziliśmy badania na roślinach Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotypu Columbia uzyskanych ze sterylnej kultury agarowej. Korzenie dwutygodniowych roślin inokulowano larwami infekcyjnymi (J2) mątwika burakowego Heterodera schachtii Schmidt. Korzenie, syncytia oraz pędy roślin kontrolnych i porażonych zbierano w 0, 3, 7 oraz 15 dniu po inokulacji (dpi). Nasze wyniki ujawniły obniżoną całkowitą aktywność proteaz w ekstraktach z korzeni roślin porażonych w ciągu całego okresu trwania infekcji. Natomiast aktywność proteaz cysteinowych zależnych od jonów wapnia Ca2+ była istotnie stymulowana. Ponadto zauważyliśmy, że aktywność proteolityczna w pędach roślin porażonych była zahamowana jedynie w 15 dpi. Zaobserwowaliśmy również, zmiany w całkowitej zawartości białek rozpuszczalnych i wyższy poziom karbonylowanych białek w pędach roślin porażonych Aby zgłębić regulację proteolizy, w roślinach kontrolnych i porażonych nicieniem, sprawdziliśmy poziom ekspresji mRNA fitocystyn. Ekspresja AtCYS1, AtCYS5 i AtCYS6 była wyższa w analizowanych tkankach A. thaliana po infekcji H. schachtii. Nasze wyniki sugerują, że zmiany i) aktywności proteaz w korzeniach i pędach oraz ii) ekspresji fitocystatyn w syncytiach, korzeniach i pędach są ważne dla metabolizmu białek podczas infekcji mątwikiem burakowym.

 

Udział fitocystatyn w odpowiedzi pszenżyta (x Triticosecale  Wittm.) na toksyczność jonów glinu. Projekt SGGW, numer: 505-10-011300-N00219-99 Kierownik projektu: dr Joanna Szewińska

Jednym z głównych czynników limitujących produktywność gleb kwaśnych jest toksyczność glinu, jednego z najbardziej rozpowszechnionych pierwiastków w skorupie ziemskiej. Wraz ze zwiększeniem się zakwaszenia gleby, wzrasta liczba monomerycznych form glinu, najbardziej przyswajalnych i toksycznych dla roślin. Pierwszym objawem fitotoksycznego działania glinu na rośliny jest ograniczenie wzrostu elongacyjnego korzeni. W glebach kwaśnych i bardzo kwaśnych spada także zdolność roślin do pobierania jonów Ca+2, Mg+2 i K+. W odpowiedzi na stresowe czynniki abiotyczne aktywacji ulegają m.in. proteazy cysteinowe z rodzin C1 i C14 oraz wakuolarne enzymy przetwarzające z rodziny C13. Niekontrolowana aktywność tych enzymów może stanowić zagrożenie dla roślin. Najbardziej bezpośrednimi regulatorami proteaz cysteinowych są ich białkowe inhibitory - fitocystatyny.

Celem badań jest poznanie udziału, zidentyfikowanych przez nas wcześniej, fitocystatyn, w odpowiedzi żyta i pszenżyta na toksyczność jonów glinu. Przeprowadzony test na tolerancyjność jonów glinu wykazał znaczne różnicę w długości nowo rosnących części korzeniowych miedzy odmianą żyta i odmianami pszenżyta. Długość tych odrostów (2.6 cm - żyto; 2.5 cm - pszenżyto odmiana tolerancyjna; 1.5 cm - pszenżyto odmiana wrażliwa) odzwierciedlała poziom tolerancji badanych roślin na obecność toksycznych jonów glinu. W korzeniach roślin stresowanych, w stosunku do roślin kontrolnych, obserwowano wzrost poziomu mRNA dwóch z pięciu badanych fitocystatyn, co może świadczyć o zaangażowaniu tych białek regulatorowych w odpowiedź rośliny na stres glinowy oraz o ich selektywnej indukcji w warunkach stresowych.

 

Wpływ chłodu na metabolizm węglowodanów w liściach ziemniaka. Projekt SGGW nr. 505-10-011300-N00223-99-41109 Kierownik projektu: mgr Dorota Sitnicka, Wykonawca: dr inż. Sławomir Orzechowski

Degradacja polisacharydów zapasowych jest jednym z mechanizmów obronnych stosowanych przez rośliny w adaptacji do niskich temperatur. Uważamy, że w warunkach działania niskiej temperatury w liściach ziemniaka indukowany jest rozkład skrobi tranzytorycznej, którego mechanizmy różnią się w badanych odmianach ziemniaka angażując różne enzymy.

W celu częściowej weryfikacji hipotezy badawczej, w ramach prezentowanego projektu, ustalono profil ekspresji genu kodującego chloroplastową α-amylazę. Dodatkowo określono zawartość skrobi oraz mono- i disacharydów gromadzonych w odpowiedzi na chłód w liściach dwóch odmian ziemniaka (Desiree i Russet Burbank).

Analizę ekspresji genu kodującego chloroplastową α-amylazę w liściach roślin poddawanych działaniu niskiej temperatury i rosnących w warunkach optymalnych przeprowadzono, aby sprawdzić czy jest ona indukowana na poziomie transkrypcyjnym. Analizę przeprowadzono techniką RT-PCR. Genem referencyjnym wybrano 18S rRNA. Sekwencja, którą poddano badaniom pochodzi z bazy danych NCBI: StAMY3 (XM_006357203). Ustalony profil wskazuje, że ekspresja badanego genu jest regulowana w cyklu dobowym u obu odmian, a chłód zaburza rytm tych zmian, zmniejszając różnice w ekspresji występujące pomiędzy końcem nocy, kiedy to ekspresja jest na niskim poziomie, a końcem dnia, kiedy w warunkach fizjologicznych osiąga szczyt. Nie wykazano istotnych różnic w ekspresji pomiędzy odmianami, co może wskazywać na inny sposób regulacji aktywności powstającej α–amylazy.

W ramach projektu sprawdzono również czy dwie odmiany w warunkach chłodu wykazują różnice w dystrybucji fotoasymilatów pomiędzy skrobią a sacharozą. W tym celu oznaczono poziomy cukrów rozpuszczalnych (sacharozy, glukozy i fruktozy) poprzez pomiar redukcji NADP przez  dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu po sekwencyjnym  dodawaniu heksokinazy, fosfoglukoizomerazy i inwertazy. W analizowanych próbach liści oznaczono także zawartość skrobi zestawem odczynników Total Starch Assay Kit (Megazyme, Bray, Ireland). Wykazano, że w odmianie Russet Burbank początkowo odpowiedź na chłód związana jest prawdopodobnie z wykorzystaniem naturalnie dostępnych w ciągu dnia cukrów rozpuszczalnych, których stężenie pod koniec nocy jest blisko dwukrotnie wyższe niż w odmianie Desiree i może przyczyniać się do opóźnienia reakcji na chłód związanej z degradacją skrobi. W liściach Desiree zwiększona zawartość heksoz obserwowana jest już po 6 godzinach działania chłodu, co w połączeniu ze zwiększona aktywnością β–amylazy wykazaną we wcześniejszych badaniach wskazuje na degradację skrobi w liściach potraktowanych niską temperaturą.

 

Streszczenia badań realizowanych w ramach działalności statutowej Katedry Biochemii temat: Biochemiczne aspekty produkcji roślin uprawnych.

 

Biochemiczna i funkcjonalna charakterystyka aminopeptydazy prolinowej TsPAP1 pszenżyta. Wykonawcy: dr Edyta Zdunek-Zastocka, dr inż. Agnieszka Grabowska

Aminopeptydaza prolinowa (PAP; EC 3.4.11.5) jest enzymem katalizującym reakcję odłączenia aminokwasu proliny lub hydroksyproliny z N-końca krótkich peptydów. Wśród roślinnych PAP, TsPAP1 z pszenżyta jest wyjątkowa gdyż w swej sekwencji aminokwasowej posiada regiony charakterystyczne dla bakteryjnych monomerycznych form tego enzymu. Interesującym  więc pozostaje poznanie funkcji tego enzymu w organizmach roślinnych. W wyniku nadekspresji genu TsPAP1 w Arabidopsis thalina otrzymano transgeniczne linie charakteryzujące się kilkanaście razy wyższą w stosunku do roślin dzikich aktywnością aminopeptydazową oraz trzykrotnie wyższą zawartością proliny. Fenotypowo linie transgeniczne nie różniły się od roślin dzikich do 17 dnia po wykiełkowaniu (DAG). Jednak 18 DAG, kiedy rośliny wykształciły 12 liści w rozecie, tylko w roślinach transgenicznych widoczne były zawiązki kwiatostanów. Kwitnienie w roślinach dzikich rozpoczęło się dopiero 22 DAG. Rośliny transgeniczne wykształciły o 20-30% więcej łuszczyn, jednak wysokość głównego pędu kwiatostanowego była średnio o około 3,5 cm większa w roślinach dzikich. Wyniki wskazują, że TsPAP1 może brać udział w regulacji zawartości proliny w roślinach, a tym samym może wpływać na procesy uzależnione od stężenia proliny w tkankach.

 

Genomika funkcjonalna dehydrogenazy glutaminianowej u pszenżyta. Wykonawcy: dr inż. Agnieszka Grabowska, dr Joanna Kwinta

Dehydrogenaza glutaminianowa (GDH, EC 1.4.1.2-3) jest enzymem katalizującym redukcyjną aminację 2 -oksoglutaranu prowadzącą do powstania kwasu glutaminowego. U wielu gatunków roślin GDH jest heksametrem, który zbudowany jest z dwóch typów podjednostek: α i β, które kodowane są przez oddzielne geny. Analiza bioinformatyczna sekwencji sklonowanego, drugiego genu u pszenżyta TsGDH2 pozwala przypuszczać, że koduje on najprawdopodobniej podjednostkę α. Aby to sprawdzić roślina modelowa – rzodkiewnik został stransformowany konstruktami genetycznymi do wyciszenia (35S::TsGDH2as) oraz nadekspresji (35S::TsGDH2s). Otrzymane linie transgeniczne fenotypowo nie różniły się od roślin typu dzikiego. Różnice były widoczne w aktywności GDH. Rośliny z wyciszonym genem GDH2 charakteryzowały się obniżoną aktywnością aminacyjną i deaminacyjną dehydrogenazy glutaminianowej. Natomiast u linii transgenicznych z nadekspresją obserwowano ponad trzykrotny wzrost obu aktywności w porównaniu z kontrolą. Wyniki elektroforezy natywnej w żelu poliakrylamidowym (PAGE) w połączeniu z wizualizacją aktywności enzymu potwierdziły przypuszczenie, że TsGDH2 koduje podjednostkę α.

 

Regulacja aktywności endopeptydaz kiełkujących ziarniaków pszenżyta. Wykonawcy: dr inż. Beata Prabucka, dr inż. Agnieszka Grabowska

Regulacja aktywności endopeptydaz cysteinowych (rodzina papainy C1), do których zaliczane są endopeptydazy aktywne w bielmie kiełkujących ziarniaków zbóż, m. in. endopeptydaza EP8, odbywa się generalnie na dwóch poziomach: hormonalnej indukcji syntezy pod wpływem giberelin oraz postulowanej regulacji aktywności pod wpływem fitocystatyn. Ważnym elementem regulacyjnym wydaje się być także aktywacja prekursorów papainowych endopeptydaz cysteinowych polegająca na usunięciu propeptydu zawierającego sekwencję inhibitorową, której mechanizm nie został jeszcze w pełni poznany. Jak wiadomo, peptydazy biorące udział w hydrolizie białek podczas kiełkowania stanowią jeden z czynników decydujących o jakości ziarniaków zbóż W minionym roku kontynuowano prace nad uzyskaniem rekombinowanych białek endopeptydaz cysteinowych hydrolizujących białka zapasowe w kiełkujących ziarniakach pszenżyta z wykorzystaniem bakteryjnego systemu ekspresyjnego E. coli, których celem jest ustalenie mechanizmu aktywacji oraz charakterystyki specyficzności tej grupy enzymów. Trwają także prace nad izolacją genów pszenżytnich homologów legumain (rodzina C13), będących potencjalnym celem działania fitocystatyn z rozszerzeniem na C-końcu, takich jak badana przez nas fitocystatyna TrcC-8. Jak dotąd ustalono pełną sekwencję pszenżytniej formy beta legumainy, której homolog jęczmienny opisywany jest w literaturze jako ulegający ekspresji we wczesnej fazie wykształcania się ziarniaków oraz podczas ich kiełkowania, co potwierdzają nasze badania.

 

Udział fitocystatyn w regulacji aktywności proteinaz cysteinowych pszenżyta ozimego (xTriticosecale Wittm.). Wykonawcy: dr Joanna Jasnos, prof. dr hab. Wiesław Bielawski

W Katedrze Biochemii od wielu lat prowadzone są badania dotyczące kiełkowania ziarniaków zbóż i związanych z tym przemian białek zapasowych. W ziarniakach zbóż gromadzonych jest wiele związków, które stanowią materiał zapasowy dla rozwijającego się zarodka. Są to przede wszystkim skrobia oraz białka. W czasie kiełkowania, białka są hydrolizowane głównie przez proteinazy cysteinowe oraz karboksypeptydazy serynowe. Dotychczas wykazano, że aktywność proteinaz cysteinowych, zarówno na etapie kiełkowania, jak i w czasie wykształcania ziarniaków, kiedy to dochodzi do ograniczonej proteolizy związanej z dojrzewaniem gromadzonych białek, jest regulowana przez specyficzne endogenne inhibitory – fitocystatyny. Są to białka roślinne uczestniczące w regulacji ważnych procesów fizjologicznych oraz w odpowiedzi roślin na niekorzystne czynniki środowiskowe. W pszenżycie zidentyfikowano 9 fitocystatyn, 7 w ziarniakach tj. TrcC-1-7 oraz 2 w liściach i korzeniach (TrcC-8 i 9). W 2016 roku kontynuowano prace nad uzyskaniem białka rekombinowanego TrcC-7, które pozwoli na analizę udziału tego inhibitora w regulacji gromadzenia i hydrolizy białek zapasowych. Wykazano jego ekspresję w wykształcających się i kiełkujących ziarniakach pszenżyta, zatem analiza jego zdolności hamowania aktywności endogennych proteinaz pszenżyta pozwoli na wnioskowanie o zaangażowaniu TrcC-7 w kontrolę proteolizy białek zapasowych.

 

Ocena przydatności lakazy grzybowej w biodegradacji ksenobiotyków. Wykonawca: dr hab. Urszula Jankiewicz

 

Celem przeprowadzonych badań było ustalenie, czy lakaza syntetyzowana przez grzyb Chaetomium globosum ma zdolność do rozkładu wybranych zanieczyszczeń środowiskowych, głownie z grupy alkilofenoli i pochodych amin aromatycznych. Jak wykazała analiza zymogramu, Chaetomium globosum wydziela do środowiska jedno białko enzymatyczne o aktywności lakazy. W badaniach wstępnych enzym oczyszczono metodami chromatograficznymi i zbadano jego właściwości biochemiczne. Badana lakaza charakteryzuje się wysokim optimum temperaturowym oraz stabilnością termiczną, jest aktywna w środowisku kwaśnym. Oczyszczony enzym wykazywał dużą zdolność do rozkładu barwników, pochodnych amin aromatycznych. Aktywność lakazy była wzmacniana w obecności hydroksybenzotriazolu (HBT), mediatora reakcji. Obecnie trwają badania nad oceną możliwości zastosowania badanego enzymu do degradacji nonylfenolu.



 
Top! Top!
cookies